扩增子，到底扩的是个什么

date

type

status

slug

summary

环境微生物应该怎么研究？

目前主流的群落研究，包括肠道、土壤、水体、口腔、阴道等，在群落微生物中，由于缺乏原位培养的环境信息，我们能够在实验室进行纯培养的只有不到3%，而其余的97%在其所处的环境稳态中又发挥着主要的作用。

~

对环境中所有微生物进行研究，就需要脱离这个培养的思路，直接从基因或者物种的角度来入手探讨其功能。

~

在环境微生物研究中，人们通常会利用指定的引物来扩增微生物的16S rDNA/18S rDNA/ITS的高度可变区域，通过测序PCR产物来分析微生物的群落结构（微生物的种类、相对丰度、进化关系等）。

RNA与核糖体蛋白结合形成核糖体，在微生物的核糖体RNA上，有着几种亚基。原核生物的核糖体包括5S、16S和23S，而真核生物有5S、5.8S、18S和28S。

~

16S rRNA为细菌核糖体RNA的一个亚基，含量高、拷贝数多，长度为1540bp，存在于所有细菌染色体中，分为保守区（9个）和高度可变区（10个），保守区序列能够体现出来细菌物种之间的亲缘关系，而高度可变区序列反映了物种间的差异。

~

因而成为细菌群落测序的分子钟，可以体现出不同菌株的差异信息。16S测序是将提取好的细菌基因组DNA，通过对某一段或几段高变区序列(V4区或V3-V4区)进行PCR扩增，建库后进行测序。

~

而编码16S rRNA的基因就是16S RDNA。严谨来说叫16S rDNA测序或者16S rRNA基因测序。类似的，18S rDNA作为真菌群落测序的标志物，既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）。

~

由于16S较长（1540bp），而当时主流的测序仪受读长的限制，我们对可变区进行测序就可以获知到菌株的分类信息。主要是对测序成本的考虑，通常测定16S或18S的某个区域，而不是对全长进行测序（三代测序可以全长测序，视课题组经费决定）。

对于不同的环境样本，应该采用特定的测序区域以获得最佳的测序结果。上面提到，16S rDNA有9个可变区域。v1-v9，大多数研究采用v3或者v4区域测序。取决于测序仪器的特点，也有v3-v4两个区域一起测的（最为常用）。除此之外，某些特殊环境样本中，采用了v6或者v2区域测序。总之，区域的选择主要是为了更多的获得细菌群落信息。而在真菌18S测序中，v4区域使用最多。

ITS测序，ITS序列为内源转录间隔区域，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2，具有种内相对一致种间差异明显的优点。

~

测序之后，我们对扩增子测序的原始下机数据先进行去接头、去引物、质控和去冗余等预处理，此后进行聚类生成OTU。

OTU（operational taxonomic units）我们叫可操作分类单元，是微生物研究中的一个基础分类单元之一，通过对序列97%的相似性聚类生成。（初学的朋友们会有点蒙，可以把它作为“种”，如果需要将微生物鉴定为菌株水平，需要宏基因组测序，以后介绍）。主流软件为qiime2、USEARCH、VSEARCH，下次会介绍分析流程及方法。